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植物過氧化氫酶CAT檢測(cè)試劑盒（鉬酸銨微板法）

  Plant Catalase Assay Kit（Ammonium molybdate，Spectrometer Method） Ver.751173-1.0

● 產(chǎn)品組成：

●  產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

植物過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒 (Plant Catalase Assay Kit)是一種簡(jiǎn)單易行的通過顯色反應(yīng)來檢測(cè)植物體內(nèi)過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性的試劑盒。測(cè)定原理簡(jiǎn)述如下：樣品中的過氧化氫酶（CAT）在過氧化氫相對(duì)比較充足的情況下，可以催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣（酶促反應(yīng)），反應(yīng)式為：2H2O2→2H2O+O2；酶促反應(yīng)后殘余的過氧化氫與鉬酸銨產(chǎn)生具有吸收波長(zhǎng)為405 nm的黃色產(chǎn)物（顯色反應(yīng)），平行對(duì)照反應(yīng)中含有已知濃度的初始過氧化氫濃度，通過計(jì)算對(duì)照反應(yīng)與樣本反應(yīng)A405讀數(shù)的差值，確定酶促反應(yīng)中有多少過氧化氫被CAT催化分解，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算出樣品中CAT活性。

本試劑盒的CAT活性測(cè)定特點(diǎn)是從紫外波長(zhǎng)（240 nm）轉(zhuǎn)換到可見波長(zhǎng)（405 nm）檢測(cè)，無需使用紫外比色皿或UV微孔板。同時(shí)也避免了使用UV測(cè)定法中蛋白質(zhì)在A240吸收對(duì)測(cè)定結(jié)果的嚴(yán)重干擾。

本試劑盒用于檢測(cè)植物樣品中的過氧化氫酶的活性，不推薦用于動(dòng)物以及體液樣品CAT活性的檢測(cè)。

使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，以每次提取使用1 ml提取液，測(cè)試體系每次0.3 ml計(jì)算，該試劑盒可以進(jìn)行約100次檢測(cè)。

● 貯存、運(yùn)輸及效期：

4℃貯存；常溫運(yùn)輸；有效期6個(gè)月。

● 自備材料：

植物材料；研缽；石英砂；聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）；1 ml石英比色皿（光程1 cm）（校正過氧化氫濃度用）；酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm）；低溫臺(tái)式離心機(jī)；可調(diào)式移液器；冰；蒸餾水。

● 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，設(shè)定波長(zhǎng)到405 nm。

2. 取出試劑盒組份，常溫放置30分鐘，平衡溫度至常溫。

3. 提前打開制冰機(jī)。

● 操作步驟：

一．試劑盒的準(zhǔn)備工作：

1.1 測(cè)定過氧化氫溶液精確濃度：

本試劑盒提供的過氧化氫濃度約為1 M。由于過氧化氫不是很穩(wěn)定，使用前需自行測(cè)定過氧化氫的實(shí)際濃度。方法如下：首先把濃度約為1 M的過氧化氫用蒸餾水稀釋100倍，使過氧化氫的濃度約為10 mM。隨后用如下方法之一測(cè)定A240：

1.1.1普通紫外分光光度計(jì)法：

使用紫外分光光度計(jì)，使用1 ml石英比色皿（光程1 cm），用蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定A240。

注：用比色皿檢測(cè)的過氧化氫濃度最接近實(shí)際濃度。

1.1.2  96孔紫外酶標(biāo)儀法(必須能檢測(cè)240 nm波長(zhǎng))：

根據(jù)96孔板的參數(shù)確定光程，一般200微升樣品的光程為0.552 cm (樣品體積除以96孔單孔孔內(nèi)橫截面面積)。一般建議使用專用的96孔紫外檢測(cè)板(如96孔UV板)，如果沒有紫外檢測(cè)板，也可使用一般的96孔板，但由于不是紫外檢測(cè)專用板，會(huì)有非常高的紫外吸收信號(hào)，所以需要設(shè)置含等量蒸餾水的孔作為空白對(duì)照(一般200 μl水在該類96孔板的A240在3.8左右)，計(jì)算時(shí)須減去該空白對(duì)照。在使用非紫外檢測(cè)專用板的情況下，由于96孔酶標(biāo)儀在240 nm的檢測(cè)上限有限，建議將過氧化氫稀釋至約10 mM左右后再進(jìn)行濃度測(cè)定。

注意：以上所有方法都需要設(shè)置等量蒸餾水作為空白對(duì)照，并在計(jì)算時(shí)減去該空白對(duì)照。

1.1.3 過氧化氫精準(zhǔn)濃度計(jì)算：

計(jì)算公式： c=A/(ε× b)。其中： c為樣品濃度(單位為mol/L或M)； A為吸光值； ε為波長(zhǎng)依賴的摩爾消光系數(shù)(單位為L(zhǎng)× mol^-1× cm^-1或M^-1× cm^-1)，過氧化氫的摩爾消光系數(shù)為43.6 M^-1cm^-1； b=光程(單位為cm)。過氧化氫濃度(M)=A240/(43.6× b)；即：過氧化氫濃度(mM)=22.94× A240/b。

示例1-微孔板測(cè)定濃度：

將本試劑盒提供的約為1 M的過氧化氫用蒸餾水稀釋100倍后，用96孔酶標(biāo)儀，使用普通96孔板進(jìn)行檢測(cè)，每孔200微升，每組3個(gè)平行。蒸餾水對(duì)照組的平均A240為3.750，過氧化氫樣品組的平均A240為3.974，差值為0.224， 200微升樣品的光程為0.552 cm，代入公式，過氧化氫濃度(mM)=22.94× 0.224/0.552=9.31 mM，則實(shí)際本試劑盒提供的過氧化氫濃度為0.931 M。

示例2-石英比色皿測(cè)定濃度：

   取蒸餾水1980 μl，加入本試劑盒提供的約為1 M的過氧化氫20 μl（稀釋100倍）混勻，取1ml混合液加入到1 ml 石英比色皿中（光程1 cm），用1 ml蒸餾水作為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定混合液的A240=0.435，代入公式，過氧化氫濃度(mM)=22.94×0.435/1=9.98 mM，則實(shí)際本試劑盒提供的過氧化氫濃度為0.998 M。

1.2 配制20 μmol/ml（20 mM）過氧化氫溶液：

根據(jù)測(cè)定得到的實(shí)際過氧化氫濃度用檢測(cè)緩沖液配制成20 μmol/ml（20 mM）過氧化氫溶液，該溶液建議使用棕色管配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃避光可以貯存3天。

注：進(jìn)行一次樣品測(cè)定，可以配制1 ml 20 mM過氧化氫溶液。

1.3 配制顯色底物：

  顯色底物提供的是粉末包裝，取一瓶粉末裝顯色底物，加入30 ml蒸餾水，徹底混勻至粉末完全溶解；顯色底物溶液配制后4℃避光貯存。

二．樣本處理：

1.1 取新鮮植物組織，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為~1：10的比例進(jìn)行冰浴勻漿，制成10%勻漿液，如0.1 g 組織，加入1 ml提取液，進(jìn)行冰浴勻漿；

注：水分充足的樣品可以制成5%勻漿液（0.5 g：10 ml）；對(duì)于纖維含量多的植物如水稻葉片，可加入適量石英砂（試劑盒不提供，自備）輔助研磨，提高研磨效率；對(duì)于多糖多酚含量高的植物，可以在提取液中加入1% PVPP（試劑盒不提供，自備），能有效去除多糖多酚對(duì)活性測(cè)定的干擾。

1.2 12000 rpm，4℃離心10 min，取上清，即為含有CAT的樣本，置冰上待測(cè)。

注：提取的樣本如需貯存，4℃貯存3天；建議按需分裝后-80℃貯存，兩周內(nèi)使用，盡量避免反復(fù)凍融；不建議-20℃貯存。

三． 樣品測(cè)定：

3.1 表一 樣品測(cè)定流程表（0.3 ml測(cè)定體系）：

在1.5 ml離心管中配制如下反應(yīng)：

3.2 酶促反應(yīng)：

參考表一，在1.5 ml離心管中，加入溶液，用移液器迅速混勻；25℃ 精確計(jì)時(shí)反應(yīng)10分鐘。

3.3顯色反應(yīng)：

立即向酶促反應(yīng)管中加入180 μl顯色底物，混勻。

3.4 讀數(shù)：

取200 μl溶液加到微孔板中，25℃孵育10分鐘后測(cè)定樣品A405。

四. 活性計(jì)算：

4.1 按照分解過氧化氫微摩爾數(shù)計(jì)算：

單位定義：在25℃ pH7.0的條件下，在1分鐘內(nèi)可以催化分解1微摩爾過氧化氫為1個(gè)酶活力單位（U/ml）。

計(jì)算公式：CAT活性（U/ml）=

注解：

△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白；△測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照；△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測(cè)定

T（min）：10，CAT酶促反應(yīng)的實(shí)際時(shí)間為10 min

過氧化氫濃度（μmol/ml）：20，酶促反應(yīng)中使用的過氧化氫濃度為20 mM（μmol/ml）

V標(biāo)準(zhǔn)（ml）：0.09，酶促反應(yīng)中加入過氧化氫體積數(shù)為90 μl

顯色反應(yīng)總體積（ml）：0.3，顯色反應(yīng)總體積為0.3 ml

V樣（ml）：酶促反應(yīng)中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)

D= 樣本稀釋倍數(shù)，未稀釋為1

1.5：300 μl反應(yīng)體系中取200 μl讀數(shù)

計(jì)算示例-綠蘿CAT活性測(cè)定-按照分解過氧化氫微摩爾數(shù)計(jì)算：

取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，按照測(cè)定步驟操作，取x=6 μl樣本測(cè)試，25℃ CAT酶促反應(yīng)10 min（T=10），加180 μl顯色工作液，常溫10 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm，讀數(shù)：A標(biāo)準(zhǔn)=0.475，A空白=0.1，A對(duì)照=0.138，A測(cè)定=0.193，△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.475-0.1=0.375，△測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.193-0.138=0.055，△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測(cè)定=0.375-0.055=0.32，CAT活性（U/ml）=0.32/0.375*0.081/0.006=11.5

4.2 按照樣本鮮重（FW）計(jì)算：

單位定義：在25℃ pH7.0的條件下，每g植物組織每分鐘內(nèi)可以催化分解1微摩爾過氧化氫為1個(gè)酶活力單位（U/g FW）。

計(jì)算公式：CAT活性（U/g FW）=

注解：

△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白；△測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照；△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測(cè)定

T（min）：10，CAT酶促反應(yīng)的實(shí)際時(shí)間為10 min

過氧化氫濃度（μmol/ml）：20，酶促反應(yīng)中使用的過氧化氫濃度為20 mM（μmol/ml）

V標(biāo)準(zhǔn)（ml）：0.09，酶促反應(yīng)中加入過氧化氫體積數(shù)為90 μl

顯色反應(yīng)總體積（ml）：0.3，顯色反應(yīng)總體積為0.3 ml

V樣總（ml）：加入提取液總體積

V樣（ml）：酶促反應(yīng)中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)

W（g）：組織鮮重

D= 樣本稀釋倍數(shù)，未稀釋為1

1.5：300 μl反應(yīng)體系中取200 μl讀數(shù)

計(jì)算示例-綠蘿CAT活性測(cè)定-按照樣本鮮重（FW）計(jì)算：

取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，按照測(cè)定步驟操作，取x=6 μl樣本測(cè)試，25℃ CAT酶促反應(yīng)10 min（T=10），加180 μl顯色工作液，常溫10 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm，讀數(shù)：A標(biāo)準(zhǔn)=0.475，A空白=0.1，A對(duì)照=0.138，A測(cè)定=0.193，△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.475-0.1=0.375，△測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.193-0.138=0.055，△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測(cè)定=0.375-0.055=0.32，CAT活性（U/g FW）=0.32/0.375*5/0.006×0.27/0.5=383.8